牛血清白蛋白（牛血清白蛋白国家标准）

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1、 蛋白质浓度的测定

2、 按照50: 1配置BCA工作液。10ulC溶液(蛋白质标准)90ulPBS溶液稀释成0.5mg/ml蛋白质标准溶液。然后将0、1、2、4、8、12、16和20ul蛋白质标准溶液分别加入96孔板的第1至第8个标准孔中，并将10ul待测样品加入其他样品孔中。分别加入PBS定容至20ul。向每个孔中加入200ulBCA工作溶液，并在室温下放置2小时。酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，根据标准曲线计算蛋白浓度。

3、 SDS-PAGE电泳

4、 1制胶：

5、 按比例准备好隔离胶，慢慢摇动溶液使活化剂混合均匀，将凝胶溶液轻轻注入两层玻璃棒中，然后小心地在液面注入一层水，防止氧气进入凝胶溶液，静置40分钟。按照之前的比例准备好浓胶，但是不要太剧烈的搅拌溶液，以免引入过多的氧气。在不连续体系的中、下层吸干分离胶上的水，连续稳定地注入凝胶溶液，然后小心地插入梳子并注意不要在齿尖留下气泡，静置60分钟以上，确保完全聚合。

6、 2预电泳：将聚合好的凝胶放入电泳槽中，小心取下梳子，加入电泳缓冲液，在10-20V的低电压下预电泳20-30分钟。(目的是去除凝胶中的杂质，

7、 疏通凝胶孔径，保证电泳过程中电泳顺利进行)。

8、 3样品制备：先计算上样体积，然后按样品：上样缓冲液=4: 1的比例加入上样缓冲液，混匀，沸水中煮沸10分钟，冰镇5分钟。

9、 4样品添加：

10、 预电泳后，依次加入标记物和待分析的样品。(加样时间应尽可能短，以避免样品扩散。您可以在孔中添加相同量的样品缓冲液，而不添加样品，以避免边缘效应。每个泳道加5ul。

11、 5电扫描：

12、 加样后，以80V的恒定电压进行电泳，直到溴酚蓝染料前沿到达两块凝胶的交界处(一般约20分钟)，以100V的恒定电压进行电泳，直到溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端，即停止电泳(一般约1小时20分钟)。

13、 膜的闭合

14、 印迹膜用TBST溶液洗涤10分钟x2次。放入5%BSA(abs49001012)密封液中，在摇床上以70 rpm摇匀，室温密封1小时30分钟。

15、 蛋白质的样品制备

16、 取心肌组织50毫克，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器的球形部分，用组织剪尽可能剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部分，按1mlRIPA 10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF(先RIPA后PMSF)，将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。

17、 将心肌组织匀浆转移至离心管中，412000g离心5分钟，收集上清液(如有粘稠物质，进一步超声处理)，样品-20保存备用。

这篇文章到此就结束，希望能帮助到大家。